◎ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果受操作影響很大，每個(gè)步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認(rèn)真負(fù)責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)。
◎因此,應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）。
加樣
◎加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍）按規(guī)定的量加入微孔板的1/3處避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
◎每次加樣應(yīng)更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。
◎樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反應(yīng)，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時(shí)注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時(shí)均需振蕩混勻。
◎如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去*滴有氣泡的試劑后加樣。
溫育
◎抗原抗體反應(yīng)需要在一定溫度下（37°C），經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間才能達(dá)到反應(yīng)的平衡點(diǎn)
◎ELISA邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能 使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。一種放在水浴箱的隔板上，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。
◎邊緣效應(yīng)（2ng/mlHBsAg一步法三種不同溫育法的結(jié)果）
洗滌
◎ELISA是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復(fù)合物及酶標(biāo)記物的目的，同時(shí)洗滌也可將非特異吸附的蛋白質(zhì)的干擾以及血球、細(xì)菌中的酶干擾清除掉。
◎手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內(nèi)反應(yīng)液；
2）用洗滌液過(guò)洗一遍（即注滿孔后即甩去）；
3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動(dòng)；
4）甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙吸干。
重復(fù)以上操作至少5次。注意各種ELISA試劑盒的洗滌液盡量不要混用。
◎洗板機(jī)洗板一定要預(yù)先把板架放平，使洗板機(jī)上的每個(gè)放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內(nèi)液體全部吸干，同時(shí)要設(shè)置一定的浸泡時(shí)間。如出現(xiàn)機(jī)洗后拍板有較多殘留液時(shí)應(yīng)再用手工洗2次以上。關(guān)機(jī)前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。
顯色
◎HRP催化底物的一步呈色反應(yīng)，同樣需要一定的時(shí)間和溫度，
◎ 一定要按照說(shuō)明書(shū)規(guī)定的時(shí)間溫度（一般為37°C，10-15分鐘）恒定反應(yīng)后終止
◎或根據(jù)臨界值質(zhì)控血清吸光度值達(dá)0.2左右使的時(shí)間而恒定反應(yīng)時(shí)間.
酶標(biāo)儀判讀結(jié)果
◎顯色反應(yīng)終止后應(yīng)立刻比色（30分鐘內(nèi)）。
常見(jiàn)的顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，以后者zui為常見(jiàn)，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。OPD終止后顯棕色，測(cè)定波長(zhǎng)為490nm；
TMB終止后顯，測(cè)定波長(zhǎng)為450nm，
二種底物的校正波長(zhǎng)均用630nm。
使用雙波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)要注意反應(yīng)板應(yīng)用紙吸干后才能置酶標(biāo)儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片。
報(bào)告方式
◎定性試驗(yàn) 國(guó)內(nèi)外為便于統(tǒng)一計(jì)算，一律按S/C.O方式報(bào)告，S為標(biāo)本A值，C.O即Cut Off值（陽(yáng)性判定值）
◎夾心法和間接法以S/C.O≥1為陽(yáng)性；
竟?fàn)幏ㄅc中和法以S/C.O﹤1為陽(yáng)性
◎Cut Off的計(jì)算公式以ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的為準(zhǔn)常見(jiàn)的有：
◎A） C.O=2.1×N（當(dāng)N不足0.05時(shí)按0.05計(jì)），
◎此公式由P/N>2.1換算而來(lái)，常用于夾心法。
◎B） C.O=0.5×N，從抑止率公式換算而來(lái)，
◎常用于竟?fàn)?，中和?br />◎C） C.O=N+C（C為常數(shù)），用于間接法。
◎D） C.O=C×P+N（C為常數(shù)），用于間接法。此公式zui客觀，但對(duì)生產(chǎn)廠家要求很高，陰陽(yáng)性對(duì)照測(cè)定值要基本恒定。
定量分析 用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋，ELISA測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以量或單位表示。
ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線每次都要和待測(cè)標(biāo)本做在同一塊板上。
◎現(xiàn)有的ELISA定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線，要得到的結(jié)果實(shí)屬不易。
因此嚴(yán)禁用定性試劑盒做定量分析。
灰區(qū)概念
把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO值上下的一段區(qū)域定為陽(yáng)性可疑，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換試劑重測(cè)以確定其陰陽(yáng)性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)則報(bào)告+（陽(yáng)性）。
灰區(qū)概念對(duì)血站系統(tǒng)的獻(xiàn)血員篩查尤為重要。
灰區(qū)的設(shè)置有二種：
1）C.O×（1±CV），
CV為該試劑的批內(nèi)CV （一般在15-20%間）；
2）C.O±2s，s為實(shí)驗(yàn)室做室內(nèi)質(zhì)控ROC的s。
高值鉤鐮效應(yīng)（HD-HOOK）
◎在二位點(diǎn)夾心ELISA中，其劑量反應(yīng)曲線的高劑量（HIGH DOSE，HD）區(qū)段，線性走向不是呈平臺(tái)狀無(wú)限后延，而是向下彎曲狀，似一只鉤子或一把鐮刀（HOOK），MILES（1974） 根據(jù)此現(xiàn)象寫(xiě)實(shí)性地稱之為"HD-HOOK"效應(yīng)。產(chǎn)生該現(xiàn)象的分子機(jī)理有"分子變構(gòu)說(shuō)"和"濃度效應(yīng)"等推論。
◎一步法和二步法均存在， 只是前者出現(xiàn)的更早些，大多數(shù)是高值低吸光度，很少陰性結(jié)果。
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